Улица, на которой стоит церковь, – одна из древнейших в городе. Она выходила из Михайловских ворот Кремля и шла на северо-запад. Улица получила имя Большой Казанской (ныне Октябрьской революции), так как отсюда начиналась дорога из Уфы на Казань, в будущем – Казанский тракт. Здесь издавна располагались усадьбы и дома уфимской знати, заводчиков: Демидовых, Твердышевых, Мосоловых.
На месте современной Спасской церкви с XVII века существовала деревянная церковь Благовещения Божией Матери. После Пугачевской смуты в Уфу стали приносить из Елабуги чудотворный образ Спаса Нерукотворного. Во время крестного хода по Большой Казанской улице в Смоленский собор носимая чудотворная икона вдруг стала, и молящиеся, несмотря на все усилия, не могли её сдвинуть с места, пока не дали обет воздвигнуть рядом с Благовещенским Спасский храм этой иконе. После молитвенного обещания икона последовала дальше. Спасская холодная церковь, как парная к теплой Благовещенской, и была построена по обету в 1779 году.
При великом пожаре Уфы 1 июля 1821 года обе деревянные церкви (Благовещенская и Спасская) сгорели. А 30 мая 1824 года старанием священника Иоанна Григорьевича Несмелова и благочестивых прихожан был заложен новый каменный храм на этом месте. Кроме главного Спасского, храм имел два боковых престола: в честь святителя Николая и в честь Рождества Христова (последний – в память сгоревшего в 1816 году Рождественского монастыря, что был ниже по Большой Казанской улице).
По мысли отца Иоанна Несмелова, Спасская церковь строилась по подобию знаменитого Казанского собора в Санкт-Петербурге: в стиле классицизма и в честь победы российского воинства над иноземными захватчиками в 1812 году.
Отличие уфимского храма от петербургского состояло в том, что в Уфе на завершениях обеих дугообразных колоннад, выходивших на красную линию улицы, были воздвигнуты две симметричные колокольни, в первом ярусе одной из них была устроена часовня, в другой – сторожка.
Основное пространство храма занимала большая трапезная (зимой становившаяся главной) и несколько укороченная летняя храмовая часть, представлявшая квадратный в плане четверик. На нём возвышался мощный, но изящный подкупольный барабан с 12-ю арочными окнами, высокими и зауженными.
Строительство велось на пожертвования прихожан и растянулось на 21 год из-за недостаточности средств. В 1829 году освятили придел в честь святителя Николая, 1 сентября 1844 года – главный храм в честь Нерукотворного Образа Спасителя, а еще через год – придел в честь Рождества Христова.
Фасад украшала колоннада из 36 колонн, с двумя колокольнями по краям. Семь колоколов для церкви были отлиты в Вятской губернии братьями Бакулевыми.
Всё пространство внутренних стен храма было расписано. Роспись купола состояла из изображений в рост между окнами 12-ти апостолов. Иконостас был трехъярусным, богато украшенным резьбой и колоннами, весь вызолоченный по полименту. Иконы были написаны в Москве в древнегреческом стиле. Среди наиболее ценных икон Спасской церкви был образ Тихвинской иконы Богородицы, богато изукрашенный; первоначально этот образ был домашним и был пожертвован по видению во сне девицы-сироты.
Церковь стала одной из градообразующих архитектурных доминант Уфы; наряду с Воскресенским собором и Александровской церковью – лучшим произведением классического стиля в Уфе. Это была единственная двуколоколенная церковь в городе и уезде.
Не будучи самой главной в Уфе, но располагаясь вблизи её географического центра, несколько десятилетий Спасская церковь имела территориально самый большой в городе приход – почти весь городской центр до западной окраины.
Наиболее известными из настоятелей Спасской церкви были И.Г. Несмелов (1823-1859), Н.П. Левитский (-1876-), Н.П. Геллертов (≈1888-≈1897), М.А. Шестаков (≈1898-≈1919), Н. Алексеев (≈-1923-), Д. Разумов (≈1924-≈1928).
Постановлением Президиума ВЦИК БАССР от 29 декабря 1929 г. Спасская церковь была закрыта. 
Здание храма было приспособлено сначала под общежитие техникума, потом в нем находилось управление кинофикации БАССР.
Были полностью разрушены колокольни и колоннады. В 40-е годы сползла в овраг алтарная апсида. В 1941-м году был снесён подкупольный барабан, произошло практически полное уничтожение редких фресок.
3 марта 1992 года Распоряжением Совета Министров БАССР Спасская церковь включена в перечень зданий-памятников и передана на баланс Министерства культуры БАССР, которое разместило там в конце 1980-х свои реставрационные мастерские.
.
В 2004 году Спасский храм был возвращен Уфимской епархии.
.
С 24 октября 2004 года в уцелевшей части храма по воскресным вечерам стали регулярно совершаться молебны с акафистом перед иконой Спаса Нерукотворного.
.
29 августа 2005 года совершена первая, после 76 лет со дня закрытия, Божественная Литургия.
По материалам П. Егорова.